Home / Trang Trại / Enzyme cellulase là gì? Phân loại, tác dụng, cách nuôi cấy

Enzyme cellulase là gì? Phân loại, tác dụng, cách nuôi cấy

/

Cellulose là hợp chất hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tự nhiên, là thành phần cơ bản cấu tạo nên thành tế bào thực vật có nhiều ứng dụng trong hóa dược phẩm.

enzym cellulase là gì

1. Cellulase là gì?

Cellulose là hợp chất hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tự nhiên, là thành phần cơ bản cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Năm 1838, Anselin Payen là người đầu tiên tìm ra cellulose trong sợi bông (chiếm 98%), sau đó những nghiên cứu khác cũng cho thấy cellulose có hàm lượng rất cao trong thực vật như ở sợi lanh (80%), gỗ (40-50%) và 50% còn lại là phức hợp polysaccharid.

Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen
Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen

Cellulose là một polymer mạch thẳng không cuộn xoắn, được tạo nên từ các đơn vị là D-glucose thông qua liên kết β-1,4-glucosid. Mức độ polymer hóa được đánh giá dựa vào số phân tử glucose trong chuỗi.

Đối với cellulose tự nhiên, con số này khoảng 10.000-14.000 và trọng lượng phân tử của cả chuỗi là 1,5 x 106 Da, dài 5 mm. Các phân tử glucose trong chuỗi polymer có dạng ghế bành, phân tử này quay 180o so với phân tử kia. Các nhóm β-OH glycoside đều nằm trên mặt phẳng ngang của các phân tử glucose.

Liên kết β-1,4 glucoside giữa các phân tử đường trong chuỗi cellulose đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính riêng của cellulose và cả vi sợi. Nhờ liên kết này mà chuỗi cellulose trở nên mở rộng, ít linh động hơn so với cấu trúc amylose của tinh bột, điều này cần cho các chuỗi cellulose để chúng có thể kết hợp với nhau và tạo thành cấu trúc dạng sợi. 

Mặt khác sự tương tác qua lại giữa các gốc đường của hai chuỗi cellulose nằm cạnh nhau cho phép tạo nên liên kết hydrogen giữa các chuỗi. Thực tế, các nhóm -OH ở các vị trí C2, C3, C6 và nhóm O-hemiacetal trong phân tử glucose đều có thể tạo liên kết hydro với các gốc đường bên cạnh trong cùng chuỗi cellulose hoặc chuỗi cellulose khác. 

Chính mạng lưới liên kết hydro mở rộng và liên kết β-1,4 glucoside đã làm cho cấu trúc cellulose trở nên bền vững, chặt chẽ có thể tồn tại trong các dung dịch kiềm và axit đậm đặc. Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơnghen, người ta đã tìm ra cấu trúc của cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi.

Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính vào khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là mixen. Mỗi vi sợi thường có khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 10 – 40 nm, dài 100-40.000 nm.

Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng

– Vùng kết tinh có trật tự cao. 

– Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với nhau nhờ lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng có thể hấp thu nước và trương phồng lên, nhờ vậy enzyme cellulase rất dễ tác động. Trong khi đó ở vùng kết tinh, các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm –OH thứ nhất của mạch này với nhóm –OH ở C3 của mạch khác nên đã ngăn cản được sự trương này. Nhờ đó mà enzyme cũng như nhiều phân tử khác khó có thể xâm nhập vào được bên trong phân tử cellulose để phân hủy.

Cellulose là một hợp chất có cấu trúc và các đặc tính lý hóa vô cùng phức tạp chỉ bị phân hủy khi đun nóng với kiềm hoặc axit. Tuy nhiên nó có thể bị thủy phân dưới tác dụng của cellulase của các vi sinh vật ở điều kiện bình thường. 

2. Enzyme cellulase 

2.1. Enzyme cellulase là gì?

Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt chúng như enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng không chặt chẽ). Một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu sự kiểm soát bởi cơ chế dị hóa. 

Cellulose là một loại phân tử polyme với các tiểu phần là D – glucose. Các gốc D – glucose được nối với nhau qua liên kết 1,4- ß-D-glycosid. 

Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzyme khác nhau: endoglucanase (1,4-ß-D-glucan-4- glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-ß-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và ß-glucosidase (ß-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau.

Đầu tiên, endoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-ß-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó exoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng ß-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose. 

2.2. Phân loại 

Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế IUBMB, hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzyme: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase ký hiệu EC 3.2.1.91 và ß-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21

2.2.1. Endoglucanase EC 3.2.1.4, enzyme CMCase hay Cx

Tên thường gọi: cellulase 

Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-ß-D-glucan-4-glucannohydrolase

Các tên khác: endo-1,4-ß-Dglucanase; ß-1,4-glucanase; cellulase A; endoglucanase; alkali cellulase; cellulase A3; celludetrinase…

Enzyme này thường thủy phân các liên kết 1,4-ß-D- glycoside trong cellulose và các ß-D-glucan của ngũ cốc.

2.2.2 Exoglucanase –EC 3.2.1.91

Tên thường gọi: cellulose 1,4-ß-cellobiosidase

Tên hệ thống: 1,4,ß-D-glucan cellobiohydrolase

Các tên khác: exo-cellobiohydrolase; exoglucanase; CBHI; cellulase C1; exo-ß1,4-glucan cellobiohydrolase…

Enzyme này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glycosid, giải phóng cellobiose từ đầu không khử. 

2.2.3. ß -glucosidase-EC 3.2.1.21

Tên thường gọi: ß-glucosidase

Tên hệ thống: ß-D-glucosid glucohydrolase

Các tên khác: cellobiase; ß-glucosid glucohydrolase; ß-1,6-glucosidase; salicilinase; arbutinase… 

Enzyme này thủy phân các gốc ß-D-glucosid.Một số trường hợp cũng thủy phân ßD-galactosidase, ß-D-fucoside; ß-D-xyloside; a-L-arabinoside. 

2.3. Tính chất

2.3.1. Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu cùa enzyme thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định. Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong phân tử cellulose và các ß- D- glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase thủy phân các gốc ß-D-glucose tạo nên phân tử D-glucose. 

2.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học

Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulose có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. 

Nhiệt độ tối ưu: 40 – 50oC 

độ pH tối ưu: thường ở giữa 4 – 5.

2.3.3. Các chất ức chế

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose.Thủy ngân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.

3. Cơ chế thủy phân cellulose

Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động hiệp đồng của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. 

Tuy nhiên, hiện nay trật tự phản ứng của các enzyme vẫn chưa có sự thống nhất và có nhiều tác giả đã trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau. Có thể tóm tắt cơ chế của một số tác giả như sau

3.1. Cơ chế của Reese (1950)

Reese là người đầu tiên đề xuất cơ chế thủy phân cellulose hòa tan bởi enzyme Cx và C1. Theo Reese thì enzyme C1 là yếu tố tiền thủy phân, nó chỉ có tác dụng làm trương nở cellulose tự nhiên tạo thành cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn. Sau đó, enzyme Cx sẽ tiếp tục phân cắt các chuỗi này tạo thành các đường tan và cuối cùng tạo thành glucose. 

3.2. Cơ chế của Erickson (1979)

Erickson và các cộng tác viên đã đưa ra cơ chế tác dụng hiệp đồng của ba enzyme là exoglucanase, endoglucanase và β -glucosidase. Đầu tiên, những vùng có mức độ kết tinh thấp trong sợi cellulose bị các endoglucanase tấn công tạo các đầu tự do.

Tiếp đó enzyme exoglucanase sẽ bắt đầu phân cắt từ các đầu tự do để tạo thành các cellobiose, cellooligosaccharide và glucose. Enzyme β-glucosidase sẽ thủy phân tiếp và cuối cùng tạo thành đường glucose. 

3.3. Cơ chế cải tiến của Reese (1980)

Năm 1980, dựa vào quan niệm của Erickson, Reese và các cộng sự của ông đã đưa ra cơ chế phản ứng mới cho phức hệ enzyme cellulase. Đầu tiên, C1 tác dụng lên cellulose kết tinh phá vỡ các liên kết đồng hóa trị và tạo ra cellulose biến tính hay cellulose trương nở. 

Sau đó endoglucanase tác dụng lên đầu chuỗi và giải phóng các cellobiose. Tiếp đó dưới tác dụng của ba enzyme: endoglucanase, cellobiohydrolase và β-1,4-glucosidase, cellulose sẽ bị phân giải hoàn toàn và tạo thành glucose.

Cơ chế chuyển hóa cellulose
Cơ chế chuyển hóa cellulose

4. Cơ chế tác dụng của cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme cellulase như endoglucanase (Cx), exoglucanase (C1) và β–glucosidase. 

Một trong ba loại enzyme trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose. Các loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme trong hệ enzyme cellulase. Hoạt tính enzyme này thường mạnh hơn các enzyme còn lại. Chính vì thế, trong điều kiện tự nhiên, một loài vi sinh vật không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose được. 

Từ những nghiên cứu riêng lẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả 3 loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. 

Có nhiều cách trình bày khác nhau, nhưng cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả. Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu. Chính vì vậy, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, nồng độ cơ chất, lượng enzyme…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. 

Quá trình thủy phân cellulase chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ 3 loại enzyme cellulase trong hệ enzyme cellulase. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt một loại enzyme. Chính vì thế ta phải khai thác enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật.

5. Vi sinh vật tổng hợp cellulase

5.1. Vi sinh vật tổng hợp cellulase là gì?

Trong điều kiện tự nhiên, cellulase bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. 

Tuy nhiên, trong thiên nhiên không có một vi sinh vật nào có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase. Các loại này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzyme này, loài khác lại tổng hợp mạnh loại enzyme khác. 

Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải này. 

Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã tiến hành tìm kiếm và phân loại các chủng vi sinh vật tham gia trong quá trình phân hủy sinh học cellulose. Kết quả có rất nhiều chủng vi sinh vật được tìm thấy, trong đó các vi sinh vật dị dưỡng là chủ yếu.

Xạ khuẩnNấmVi khuẩn
ctinomyces cellulose
A. Diastaticus
A. Roseus
A.thermofucus
A.roseus
Adiasstatic
Micromonospora vulgaris
Streptomyces rectus
S. thermofuscus
S. thermonitrificans
S. thermoviolaceus
S. thermovulgaris
S. violaceus-aurriu
S. diastaticus
T. vulgaris
Thermomonospora curvata
Aspergillus niger
A. oryzae
A. terreus
A. syndovii
A. flarus
Pen. notatum
Cephalosporium
Mucor pusilus
Neurospora
Trichoderman reseii
T. viridae
T. lignorum
T. hazianum
Aabasii diomycetes
Fusarium culmorum
Chrysoporium ligaorum
Pseudomonas fluorescens
B. amylogenas
B. flavefacicus
B. megaterium
B. mensenteroides
B. ruminicola
Clotridium sp
Acetobacter xylinum
Vi khuẩn dạ cỏ
Ruminococcus albus
Ruminobacter parum
Bacteroides
Amylophillus sp
C. butyricum
C. locheheadii
Cellulosemonas
Vi sinh vật phân hủy lignocellulose
EnzymeChủngCơ chấtHoạt
tính
Nhiệt độ
tối ưu
pH
tối ưu
mannan endo-1,4-
β-mannosidase
Bacillus
subtilis
Galactoglucomannan/
glucomannans/mannans
51450-605-7
cellulaseClostridium
thermocellum
Galactoglucomannan/
glucomannans/mannans
428757
1,3-β-glucan
glucohydrolase
Streptomyces
murinus
Laminarin6,7506
1,3-β-glucan
glucohydrolase
Bacillus
macerans
β-D-glucan/ lichenan503060-656
1,3-β-D-glucan
glucanohydrolase
Bacillus sp.3-O-β-D-Glc-D-Glc-D-
Glc-D-Glc/ laminarin
369,6609
Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg)

5.1.1. Xạ khuẩn

Nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng phân giải cellulase của xạ khuẩn Streptomyces, Actinomyces… Các tác giả cũng nhấn mạnh rằng trong cùng một loài, hoạt tính phân giải cellulose của các chủng khác nhau thì sẽ khác nhau. 

Loại 1: A. coelicolor, A. sulfureus, A. aureus, A. ellulosae, A. Chromogenes, A. verne, A. glaucus… 

Loại 2: A. hydroscoopicus, A. griseoflavus, A. albidus, A. viridans, A. griseolus…

Loại 3: A. thermoficus, A. xanthosromus. 

Loại 4: A. flavochromogenes, A. bovis, Act. sampsonii. 

5.1.2. Vi khuẩn

Vi khuẩn chủ yếu sinh ra endoglucanase và ß- glucisudase, gần như không tạo ra exoglucanase. Người ta phân tích thấy rằng có đến 15 – 20 tỷ vi khuẩn/ 1cm3 chất có trong dạ cỏ ở động vật ăn cỏ (1960 – Gorbacheva), các loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ cỏ

– Ruminococcus albus (Berger, 1963; Curilov, 1971). 

– Ruminococcus flavefaciens 

– Ruminobacter parum – Butyviribrio fibrisolvens 

– Cillobacterium – cellulosove

Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. (Nov). và Cellulomonas iranensis sp. Nov (Elberson, 2000).

Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium thermcellum, Clostridium cellulovorans (Murashima, 2002), Clostridium cellulotiticus (Parsiegla, 1998). 

5.1.3. Nấm khuẩn (Myxobacteria) 

Bao gồm các giống

– Promyxobacterium 

– Cytophaga 

– Sporangium 

– Sporocytophaga  

5.1.4. Nấm sợi

Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Cladospochung. Một số chủng nấm mốc đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao

– A. flavus; A. niger; A. oryzae, …

– Chaetomium globosum; C. elatum; C. fumicolum…

– Mucor pusillus – Penicillium notatum; Pen. variabite; P. pusillum  

– Trichoderma koningi; Trichoderma vidide… 

– Sporotrichum pruinosum. 

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. 

Quá trình thủy phân cellulase chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ các loại enzyme cellulase trong hệ enzyme cellulase. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt một loại enzyme. Chính vì thế ta phải khai thác enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật.

5.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase

Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống Trichoderma, Aspergillus, Penicillium,…Trong đó Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast & Saha, 1997). Phần lớn các chế phẩm cellulase thương mại được sản xuất chủ yếu từ các chủng nấm. 

5.2.1. Aspergillus niger

Giống Aspergillus là nhóm nấm sợi bao gồm các loài khác nhau. Một vài loài có khả năng gây bệnh như A. fumigatus, A. flavus, A. pasiticus. Tuy nhiên, hầu hết các thành viên của nhóm này có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là các loài nấm đen A. niger, A. turbingensis, A. oryzae. Nhờ khả năng sinh ra loại enzyme như amylase, cellulase, hay protease khi nuôi cấy trên một số môi trường đặc thù. Được ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý nước thải.

Chủng Aspergillus đều thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti). Aspegillusniger cuống đính bào tử có đầu phình ra. Nhóm nấm bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuổi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử.

Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger).  

Aspergillus niger tiết ra nhiều endo-β-glucanase (Cx), β-glucosidae và rất thấp exo- βglucanase (C1).

5.2.2. Nhóm Trichoderma

Nhóm Trichoderma gồm Trichoderma koningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride đã được nghiên cứu và ứng dụng sản xuất cellulase. Các chủng Trichoderma tạo ra endo-β-glucanase (Cx), exo-glucanase (C1) nhưng rất ít βglucosidae, các cellulase từ Trichoderma thường hoạt động ở vùng pH 4-8.

5.2.3. Nhóm vi khuẩn 

Rất nhiều chủng vi sinh vật chịu nhiệt có hoạt tính cellulase được tìm thấy trong đống ủ compost. Trong nhóm vi khuẩn, các chủng thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu thế (87%). Có nhiều chủng đã được phân lập và định tên đến loài bao gồm: Bacillus amylogenas, B. flavefacicus, B. megaterium, B. mensenteroides, B. ruminicola, B. pumilus EB3. Ngoài ra các chi Acinetobacter, Pseudomonas, cellulomonas và Clostridium cũng được tìm thấy trong đống ủ. 

Trong xử lý rác thải, các chủng thuộc chi Baccillus vẫn là đối tượng được quan tâm nhiều nhất vì chúng là những chủng ưa nhiệt và sinh bào tử nên có khả năng tồn tại và sinh trưởng tốt trong các đống ủ compost có nhiệt độ cao.

Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng do vi khuẩn có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo được nhiều sinh khối hơn. Tốc độ phát triển của nấm thấp hơn do đó giá thành khi sản xuất chế phẩm sẽ cao hơn. 

Cellulase do vi khuẩn sinh ra thường là những chất xúc tác có hiệu quả cao và không bị kìm hãm bởi các chất trung gian trong quá trình thuỷ phân (kìm hãm ngược). Quan trọng nữa là các vi khuẩn dễ được tái tổ hợp theo công nghệ gen.

6. Ứng dụng của enzyme cellulase vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase rất có ý nghĩa và có nhiều ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn. 

– Ngoài ứng dụng trong công nghệ xử lý rác thải, enzyme cellulase của các chủng vi sinh vật này còn được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống. 

– Enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. 

– Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường. 

– Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. 

– Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. 

Ứng dụng enzyme cellulase phá vỡ tế bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các nhân tố di truyền. Do đó phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học. Theo Gascoigne (1960) và Coughlan (1979) enzyme cellulase của vi sinh vật được ứng dụng trong các lĩnh vực sau

6.1. Chế biến thực phẩm 

– Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn. 

– Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau quả. 

– Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men. 

– Chế biến thạch từ rau câu. 

– Sản xuất thực vật đơn bào. 

– Sản xuất etanol, butanol, acetone, glycerol, và một số axít hữu cơ ( axit acetic, axit citric, axit fumaric…). 

6.2. Dược phẩm

– Chế các chất tự tiêu hóa . 

– Loại bỏ các sợi không mong muốn. 

6.3. Thức ăn gia súc

– Cải thiện khả năng tiêu hóa cỏ, rơm làm thức ăn gia súc. 

– Sản xuất thức ăn giàu protein. 

6.4. Chống ô nhiễm 

– Làm sạch các bãi rác thải thành phố, phân hủy rác thải thành phân bón. 

– Xử lý phần trong các bể thải để làm khí đốt. 

6.5. Lên men

Cung cấp cơ chất lên men cho việc tổng hợp metan, ethanol, glycerol, axit citric, axit amin, vitamin, protein đơn bào, các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học khác.

Một trong những vấn đề đáng quan tâm trong việc sản xuất cellulase thương mại là giá thành của enzyme thu được. Giá của enzyme chiếm tới 50% chi phí cho quá trình thuỷ phân cơ chất. 

Theo nghiên cứu của Walker và Wilson (1991) giá của 1mg cellulose được sản xuất là 55 USD, trong khi đó giá của cellulase là 2665 USD/mg. Tuy nhiên giá của enzyme đã giảm trong 20 năm qua, nhưng còn rất cao. Do đó đã có rất nhiều nỗ lực để giảm giá thành của enzyme, có thể tổng kết trong 3 nhóm biện pháp sau

1. Tuyển chọn các loài có những enzyme mới; 

2. Cải thiện các loài đang được sử dụng và công nghệ sản xuất enzyme; 

3. Tìm các nhân tố tối ưu cho quá trình sản xuất và vận hành như cơ chất, điều kiện nuôi cấy, sử dụng lại enzyme… 

Ngoài ra để tăng hoạt tính của enzyme, người ta đã tìm ra biện pháp tạo ra hỗn hợp enzyme bằng cách phối hợp một số enzyme riêng biệt (hoặc phân đoạn có hoạt tính) từ các cơ thể sinh enzyme hoặc các cơ thể tái tổ hợp với nhau. 

Hỗn hợp này bao gồm các enzyme tinh khiết từ các cơ thể khác nhau, hoặc là các enzyme thô với một enzyme tinh khiết, hoặc gồm một enzyme tinh khiết với các vùng gắn cellulose từ một cơ thể khác, hoặc với các co-factơ khác nhau… 

Thêm enzyme cellobiohydrolase 1 (C1) tinh khiết của Trichoderma reesei vào chế phẩm cellulase thô của Thermonospa fuscađã làm tăng hoạt tính thuỷ phân giấy lọc (C1) lên gấp 2 lần khi dùng từng enzyme riêng biệt.

Việc nghiên cứu tìm ra được những nhóm vi sinh vật thích hợp cho từng loại cơ chất để cellulase có khả năng thuỷ phân tốt là một vấn đề không đơn giản. Vì thế việc nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao để thuỷ phân bã thải agar cho hiệu quả cao là rất cần thiết. 

7. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu

Để sản xuất cellulase cần có môi trường nuôi cấy thích hợp, nguồn nguyên liệu cung cấp là bông thấm nước, giấy lọc, giấy báo, các phụ phẩm chứa cellulase trong nông nghiệp như bột rơm rạ nghiền nhỏ, cám bã, bột ngô, bột củ cải,.. nguồn cung cấp N là muối nitrat, muối amon, … 

Một số môi trường thường sử dụng như:

 – Môi trường nuôi nấm Tricoderma: KH2PO4: 0,2%; (NH4)2SO4: 0,14%; URE: 0,03%; MgSO4.7H2O: 0,03%; CaCl2: 0,03%; FeSO4.7H2O: 5mg/; MnSO4.H2O: 1,56 mg/l; ZnSO4.7H2O: 1,4 mg/l; CoCl2: 2mg/l; Pepton: 0,1% 

Môi trường nuôi chủng Asp.terreus: KH2PO4:0,1%; NaNO3: 0,3%; MgSO4.H2O: 0,05%; KCl: 0,05%; FeSO4.7H2O:0,01%; Cao bắp: 0,5%; Giấy lọc: 2%

Môi trường khoáng chung cho loại cellulase: NH4NO3 1 g, K2HPO4 0,5 g, KH2PO4 0,5 g, MgSO4. 7H2O 0,5 g, NaCl 1 g, CaCl2 0,1 g, FeCl3 0,02 g, cao men 0,05 g, nước cất 1000 ml, pH = 7,0 – 7,2

8. Phương pháp thu nhận enzyme cellulase

Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt bằng môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). 

Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trong môi trường xốp có độ ẩm 60-65%, có cơ chất là cellulose. Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulose và phải có độ xốp nhất định để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào bên trong khối môi trường. 

Cả 2 nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những vi sinh vật hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxi. Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển trong môi trường kiềm và môi trường axit yếu, còn nấm sợi phát triển trong môi trường axit. 

Do đó khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ khuẩn từ 6,2 – 7,6; còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5 – 5,5. Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase của xạ khuẩn và nấm sợi cũng khác nhau. 

Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 – 48 giờ đã cho hoạt tính enzyme cellulase rất cao. Trong khi đó xạ khuẩn phải mất ít nhất 72 giờ mới tổng hợp cellulase nhiều. Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của 2 nhóm vi sinh vật này, các loài xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. 

Enzyme cellulase của xạ khuẩn cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzyme cellulase của nấm sợi. Sau khi nuôi cấy trong điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và enzyme. 

Công việc tiếp theo là sử dụng những phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối vi sinh vật sẽ thu được enzyme dạng bán tinh khiết. Enzyme bán tinh khiết còn chứa nước, protein không hoạt động và enzyme. Bằng những phương pháp hóa, lý ta sẽ loại được nước, protein không hoạt động khi đó ta thu được chế phẩm enzyme tinh khiết. 

Các loại nấm sợi như Aspergilus và Trichoderma thường được dùng làm đối tượng để sản xuất cellulase ứng dụng nhiều trong thực tiễn.

Để sản xuất ra sản phẩm theo công nghệ ứng dụng vi sinh cần có những điều kiện sau: Giống vi sinh, môi trường nuôi cấy, nguồn nguyên liệu (cơ chất) và quá trình lên men (cấy giống, lên men và thu nhận sản phẩm). Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy là quá trình lên men vi sinh.

Đây là quá trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống, nhân giống sinh khối, lên men và thu nhận sản phẩm cuối cùng. Các giai đoạn này có liên quan mật thiết và ảnh hưởng qua lại với nhau. Để tạo được sản phẩm, quá trình lên men theo 3 giai đoạn

8.1. Giai đoạn giữ giống gốc, nhân giống sinh khối và nhân giống sản xuất

– Giống gốc được mua từ các Trung tâm thực nghiệm, trường Đại học, Viện nghiên cứu…rồi nhân giống sinh khối theo môi trường thích hợp và nhân giống sản xuất đại trà 

– Nếu không có giống gốc thì phải phân lập giống từ tự nhiên hoặc từ các cơ sở sản xuất. 

8.2. Giai đoạn lên men

Giai đoạn này có 2 quá trình lên men cơ bản là quá trình lên men hiếu khí và quá trình lên men yếm khí (kỵ khí). 

8.3. Giai đoạn thu nhận sản phẩm lên men

Tùy theo mục đích thu nhận sản phẩm mà có các phương pháp thu nhận sản phẩm khác nhau. Dưới đây là một số phương pháp chủ yếu

– Thu nhận chế phẩm enzyme vi sinh vật thô từ phương pháp nuôi cấy chìm: phương pháp lắng tủa, lọc, ly tâm… 

– Thu nhận chế phẩm enzyme vi sinh vật thô từ phương pháp nuôi cấy bề mặt 

– Thu nhận chế phẩm enzyme bán tinh khiết Trong nhiều trường hợp ứng dụng, người ta dùng chế phẩm enzyme thô và trong nhiều trường hợp người ta dùng chế phẩm enzyme bán tinh khiết và chế phẩm enzyme tinh khiết.

Để thu nhận được chế phẩm enzyme bán tinh khiết, người ta dùng các tác nhân gây tủa protein như: cồn, acetone, muối trung tính…, sau đó ly tâm thu chế phẩm enzyme, theo phương pháp thu chế phẩm enzyme bán tinh khiết giá thành của enzyme sẽ cao, khi ứng dụng đại trà sẽ có nhiều hạn chế.

Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc.Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.

Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. 

Ứng dụng enzyme cellulase phá vỡ tế bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các nhân tố di truyền.

Do đó phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học. Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.

This div height required for enabling the sticky sidebar
error: Content is protected !!
Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views :