Home / Trang Trại / Cách trồng sâm Ngọc Linh đúng kỹ thuật sản xuất quy mô lớn

Cách trồng sâm Ngọc Linh đúng kỹ thuật sản xuất quy mô lớn

/

Hướng dẫn cách trồng sâm Ngọc Linh từ rễ bất định và rễ thứ cấp để sản xuất trên quy mô lớn, đúng quy trình, cây sinh trưởng tốt.

sâm ngọc linh có tốt không

1. Chuẩn bị dụng cụ và trang thiết bị

1.1. Nguồn mẫu rễ cây

Mẫu rễ bất định (RBĐ) 30 ngày tuổi được tách ra từ các cụm RBĐ nuôi cấy trên môi trường SH bổ sung 5 mg/L IBA hiện có tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên.

1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

1.2.1. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị dùng trong nuôi cấy rễ thứ cấp (RTC) sâm Ngọc Linh: cân điện tử, bếp ga, máy cất nước, máy đo pH, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, máy bơm khí, hệ thống lọc khí. 

Hệ thống Bioreactor gồm 2 dạng Bioreactor tự tạo (bình tam giác 3L Merck, Đức) và Bioreactor hình cầu 3L (Hàn Quốc); được thiết kế với hệ thống bơm khí của máy nén khí TW-OF550-9L (Wing, Việt Nam) với van điều áp R72G-2GK-RMN đưa tốc độ dòng chảy về 0,05vvm; luông khí đi qua hệ thống lọc tự thiết kế (bình làm mát, bình làm khô không khí, bình chứa không khí) và đi qua màng lọc Millipore (kích thước lỗ 0,2µm, đường kính 4cm) vào Bioreactor qua Sparger một lỗ khí tạo ra các bọt khí có đường kính dưới 0,5μm (Bioreactor hình cầu); Sparger nhiều lỗ tạo các bọt khí có đường kính dưới 0,5-1 μm (Bioreactor bình tam giác).

Luồng khí đi ra cũng được lọc qua mang Millipore. Dụng cụ dùng nuôi cấy: dao cấy, đĩa cấy, pank cấy, bình nuôi cấy 250mL, bình tam giác 250mL và 3L, màng lọc Millipore (kích thước lỗ 0,2µm, đường kính 4cm và 2cm). Dụng cụ khử trùng ở 121°C, 1atm trong 20 phút.

Thiết bị dùng trong phân tích HPLC: Máy HPLC của Shimadzu với hệ thống bơm LC-2OA-D, Degasser DGU-20A5, đầu dò DDA SPD-MZOA và cột SapeIco C18; Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H, tủ cấy Sanyo MOV-112, tủ Sấy Menmert, cân kỹ thuật Prescisa (Nhật Bản), đèn UV hai bước sóng 254 nm, 365 nm, Viber Luormat (Pháp), bể cách thủy Menmert WB. 14, bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60F254 (Mérck), máy soxhlet, bình sắc ký.

1.2.2. Hóa chất

Các elicitor: jasmonic acid-JA (95%), salicylic acid-SA (99%), absisic acid-ABA (98%), dịch chiết nấm men (yeast extract-YE) của hãng Duchefa Biochemie, Hà Lan. YE là hỗn hợp các amino acid, peptide, vitamin tan trong nước và carbohydrate. CHN (chitosan) từ vỏ tôm của hãng Merck KGaA, Darmstadt, Đức. CHN chứa 75% deacetylated, 10 mg/L acetic acid 1M.

Chất chuẩn: G-Rg1 (độ tinh sạch > 98%), G-Rb1 (độ tinh sạch > 98%), MR2 (độ tinh sạch > 90%) có tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh. 

Thành phân đa lượng, vi lượng và các vitamin của hãng Duchefa Biochemie, Hà Lan; các chất điều hòa sinh trưởng (IBA, NAA, 2,4-D, KIN, TDZ, BA,…) của hãng Merck KGaA, Darmstadt, Đức.

1.2.3. Dung môi phân tích HPLC

Methanol, diethyl ether, n- butanol, acid acetic, acid sulfuric, ethanol. n-butanol:acid acetic:nước (7:1:2)

Chloroform:methanol:nước (65:35:10)

2. Cách nuôi cấy in vitro sinh khối rễ bất định và rễ thứ cấp

Saponin triterpenoid có cấu trúc phức tạp nên tổng hợp hóa học không có khả năng cạnh tranh kinh tế khi sản xuất trên quy mô lớn. Do đó, nguồn saponin từ sâm Ngọc Linh chủ yếu được chiết xuất từ cây trồng ngoài tự nhiên nhưng phải đối mặt với rất nhiều khó khăn. 

Khi so sánh hiệu quả sản xuất các saponin chính trong nuôi cấy tạo các phần khác nhau của cây sâm Ngọc Linh cũng thấy hàm lượng saponin trong nuôi cấy mô sẹo là thấp nhất (1,04 mg/g MR2; 0,08 mg/g Rg1; 0,06 mg/g Rb1), RBĐ cao hơn (3,79 mg/g MR2; 0,48 mg/g Rg1; 0,30 mg/g Rb1. Dựa trên phân tích TLC đã kết luận rằng, thành phần ginsenoside trong in vitro giống với ngoài tự nhiên.

2.1. Khái niệm về rễ bất định là gì?

Rễ bất định (RBĐ) là những rễ phát sinh từ trục thân hay những cơ quan tự nhiên khác nhau. Về cơ bản, RBĐ có nguồn gốc nội sinh, do sự phản biệt hóa của tế bào nhu mô nằm xung quanh hệ thống mô mạch dưới tác động của auxin.

Trong quá trình phản biệt hóa, tế bào từ vùng tủy đến vùng vỏ hồi phục lại khả năng phân chia tế bào. Tuy nhiên, chỉ có một số tế bào nhất định như tế bào nhu mô libe thuộc mô phân sinh mới có khả năng biệt hóa thành sơ khởi rễ. Các tế bào phân chia khác thuộc nhóm tế bào phân chia ngang không tham gia vào sự biệt hóa sơ khởi tạo rễ.

Hơn nữa, sự phân chia tế bào cũng xuất hiện ở những mẫu cấy không phải là rễ khi xử lý với auxin. Vì vậy, sự phân chia tế bào ở vùng nhu mô không hoàn toàn có khả năng tạo sơ khởi RBĐ; chỉ có sự phân chia của tế bào ở những vị trí xác định và chuyên biệt mới dẫn đến hình thành mầm rễ.

2.2. Khái niệm về rễ thứ cấp là gì?

Rễ thứ cấp (RTC) hay còn gọi là rễ bên, rễ phụ, là một trong những phần quan trọng không thể thiếu của hệ thống rễ. Các sơ khởi RTC được hình thành từ các vùng ngoại vi của trụ bì trưởng thành ở những khoảng cách khác nhau từ các mô phân sinh đỉnh của rễ.

Nguồn gốc của RTC là từ các mô sâu bên trong rễ chứ không phải từ bề mặt bên ngoài. Sự hình thành rễ bắt đầu từ sự phân chia song song từ trụ bì tạo ra một lớp tế bào đôi. Ngay sau đó, các sơ khởi rễ bắt đầu biệt hóa tế bào, bằng chứng là biểu hiện gen khác biệt trong các lớp tế bào bên trong và các lớp tế bào bên ngoài.

Sơ khởi RTC phát triển thông qua một chương trình phân chia tế bào rất đặc trưng để tạo ra một cấu trúc giống hệt khuôn mẫu của rễ chính. Sau khi mầm RTC được hình thành, nó sẽ trở thành một rễ trưởng thành thông qua một quá trình gồm hai giai đoạn. Đầu tiên, các tế bào quanh trụ bì gia tăng kích thước hình thành các mầm rễ nổi lên xuyên qua các mô tế bào bao phủ.

Sự gia tăng kích thước tế bào đặc biệt rõ ràng trong các tế bào gần mầm rễ, trong khi số lượng tế bào vẫn không có thay đổi lớn. Thứ hai, các RTC mới bắt đầu mọc dài ra và tại đầu rễ số lượng tế bào tăng mạnh. Đây là đặc trưng của sự kéo dài rễ trưởng thành thông qua việc phân chia tế bào trong các mô phân sinh đỉnh rễ nên RTC có nguồn gốc nội sinh.

Tùy thuộc vào thứ tự các rễ mọc ra, mà sau đó gọi là RTC bậc 1, RTC bậc 2, RTC bậc 3,…. Thông thường, RTC của thực vật hạt trần và thực vật hạt kín hình thành từ trụ bì của rễ chính hoặc trên RBĐ. Về mặt lý thuyết, tất cả các tế bào trụ bì có khả năng cảm ứng hình thành RTC, nhưng dưới điều kiện bình thường chỉ có các tế bào trụ bì gần cực xylem hoặc cực phloem nhất và tùy thuộc vào các loài thực vật khác nhau mới thực hiện chức năng này. Trái lại, ở một số cây, rễ phát sinh từ nội bì như các cây thuộc ngành dương xỉ.

2.3. Yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp và rễ bất định

2.3.1. Loại mẫu cấy

Để tạo RBĐ, lá non hoặc các chồi non cho khả năng hình thành RBĐ hiệu quả hơn các loại mẫu khác. Điều này có thể là do lá non là nơi sản xuất auxin và chồi là nơi tích trữ auxin. Vị trí cắt của lá được sử dụng làm mẫu cấy cũng có tác động lên số lượng rễ được hình thành.

Các đoạn thân có chồi bên hoặc chồi ngọn hoặc lá trên đốt cắt thường kích thích sự hình thành RBĐ mạnh hơn. Sự chuyển vị của các carbohydrate từ lá góp phần vào sự tạo rễ. Khi đưa mẫu từ bên ngoài vào nuôi cấy in vitro, qua vài lần cấy chuyền mẫu cấy sẽ được trẻ hóa thông qua tác động của các cytokinin.

Tuy nhiên, dòng thực vật được trẻ hóa không thể tiếp xúc với BA quá lâu, vì khi đó cytokinin sẽ mất khả năng kích thích phát sinh cơ quan, gây ra hiện tượng thủy tinh thể. Chính vì thế, tình trạng trẻ hóa của mẫu in vitro được duy trì nhờ sự xen kẽ giữa các lần cấy chuyền sang môi trường có và không có BA.

Trong nuôi cấy RTC, hầu hết các nghiên cứu thực hiện với rễ cây hoàn chỉnh nhằm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự định hướng của rễ, sự hấp thu chất dinh dưỡng, sinh lý của rễ, ảnh hưởng của rễ đến cây trồng và đưa vào ứng dụng ngoài đồng.

Tuy RTC được ghi nhận chủ yếu trong các nghiên cứu ở rễ cây hoàn chỉnh nhưng một số nghiên cứu khác còn sử dụng RBĐ nhân nhanh RTC để nghiên cứu thu nhận sinh khối và sản xuất các hợp chất thứ cấp. Trong một rễ hoàn chỉnh, mỗi phần khác nhau của rễ đều có vai trò khác nhau, trong đó, phần phát sinh RTC chỉ diễn ra tại vùng kéo dài ở miền sinh trưởng của rễ.

2.3.2. Vị trí phát sinh

Rễ bất định chủ yếu có nguồn gốc từ những vị trí tế bào xung quanh mô mạch, mô tủy hay ở nhu mô, vài trường hợp có nguồn gốc là ngoại sinh, từ tế bào biểu bì. Cách hình thành và vị trí hình thành sơ khởi rễ ở nhiều loài cây khác nhau cũng không giống nhau.

Ở cây thuộc họ liễu và cây thân gỗ, sơ khởi rễ chủ yếu khởi đầu ở vùng tượng tầng phát sinh gỗ (Acer pseudoplatanus), nhu mô của mạch ray (Populus simonii), khoảng không bào của lá và chồi (Lonicera japonica, Malus spp.).

Sơ khởi rễ cũng có thể bắt đầu từ các cụm tế bào nhu mô libe của trụ dưới lá mầm cây hướng dương (Heliathus annuus) hoặc từ tượng tầng bó mạch ở đốt thứ sáu bên dưới đỉnh ngọn của cây khoai lang (Ipomoea batatas). Đối với cây hạt trần, sự hình thành rễ thường gặp nhiều khó khăn vì thân thường không có sẵn các tiền sơ khởi rễ.

Vì vậy, RBĐ của cây hạt trần thường gọi là rễ do vết thương cảm ứng. Sơ khởi của những rễ hình thành từ vết thương có nguồn gốc từ các tế bào ở mặt trong của vỏ (Cercis canadensis), tế bào nhu mô libe và vùng phát sinh gỗ ở cây táo (Mallus domestica), khoảng không bào ở lá và chồi Malus pumila, trụ bì Abies procera và từ mô sẹo Abies firma.

Đối với cây thân thảo, sơ khởi RBĐ hình thành từ các mô: trụ bì của thân ở cây cà chua, bắp; nhu mô ở mạch ray giữa trụ bì và tượng tầng phát sinh gỗ (Lonicera japonica); cụm nhu mô (Azukia angularis); bó tượng tầng phát sinh gỗ và nội bì (Portulaca oleracea); bó tượng tầng phát sinh gỗ, nội bì và libe (Begonia). Vị trí phát sinh RTC liên quan tới cấu trúc xylem ở trung trụ. Ở cây Arabidopsis thaliana, trung trụ gồm hai vòng và các RTC phát sinh từ các tế bào nền trụ bì (TBTB) nằm ở các ngăn gần kề với các cực của trung trụ.

Do vậy, các rễ sơ cấp cây A. thaliana tạo thành hai cột hay hai dãy ở vị trí 180º. Không phải tất cả các tế bào trụ bì nằm đúng vị trí giải phẫu này đều hình thành các mầm RTC mà chỉ có một số trực tiếp khởi đầu chu trình phát triển RTC. Điều này có thể do các tế bào trụ bì cố định được nhận dạng ở giai đoạn sớm hơn đảm nhận nhiệm vụ này và kéo theo sau đó là chu trình phát triển đã định trước.

Tuy nhiên, khi sử dụng các auxin ngoại sinh, tách bỏ đầu chóp rễ hay bổ sung thêm các khoáng chất cũng làm gia tăng khả năng khởi tạo RTC lên rất nhiều lần. Hơn nữa, không phải tất cả các tế bào trụ bì nằm đúng vị trí đặc biệt ở các cực mô gỗ sơ cấp mới có khả năng kích thích hình thành RTC khi vắng mặt các yếu tố quyết định ban đầu.

Nhiều quan điểm cho rằng, tất cả quá trình khởi tạo RTC gồm cả quá trình phản biệt hóa các tế bào trụ bì nằm trong một chu trình tế bào. Dựa trên đánh giá về độ dài của chu trình tế bào và tốc độ phát triển của rễ chính cho thấy rằng, một số RTC phát triển từ các tế bào trụ bì đã được lên chương trình trước thông qua chu trình tế bào liên tục từ lúc bắt đầu ở mô phân sinh đỉnh.

Gần đây, các dữ liệu đã được nghiên cứu sâu hơn để chứng minh cho giả thuyết này. Đa số các nghiên cứu cho thấy các tế bào trụ bì cực xylem tiếp tục chu trình biệt hóa và không bị gián đoạn sau khi đã tách bỏ mô phân sinh đỉnh rễ.

Do đó, hầu hết trụ bì vẫn ở pha G1, và chỉ có các tế bào trụ bì ở cực xylem được lập trình từ pha G1 lên G2. Các kết quả này hợp thành một luận cứ hỗ trợ cho luận điểm về quá trình hình thành mô phân sinh đơn bào ở vùng đỉnh còn non của rễ nằm trên vùng kéo dài.

Ngược lại, các RTC phát triển từ các vùng trưởng thành của rễ sơ cấp hầu hết chắc chắn cần phản biệt hóa và được chuyển hóa từ các tế bào trụ bì được thiết lập trước đó trong chu trình tế bào.

Ở cây A. thaliana, hiện tượng phát sinh hình thái đầu tiên liên quan đến việc khởi tạo RTC diễn ra khi hai TBTB nằm ở cùng một cột gần như đồng thời phân chia bất đối xứng và theo chiều ngang.

Quá trình này tạo ra hai dẫn xuất trụ bì ngắn nằm từ đầu này sang đầu kia trên cùng một cột được bao bọc ở phía trên và phía dưới bởi hai dẫn xuất trụ bì dài hơn. Tiêu chuẩn phát sinh hình thái này cho phép nhận dạng chính xác vị trí khởi tạo RTC.

Tiếp theo đó, các TBTB trải qua các quá trình phân chia theo kiểu bất đối xứng, theo chiều nghiêng, vòng cung, lồi lên và xiên qua làm gia tăng các nhóm dẫn xuất chứa các mầm RTC. Hình thành mô phân sinh là một quá trình gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu, các tế bào phân chia rất nhanh và khá đồng đều để tạo thành mầm rễ; giai đoạn tiếp theo là sự hình thành các mô phân sinh mới bên trong mầm rễ.

2.3.3. Vai trò điều hòa của auxin

Hầu hết các nuôi cấy mô sẹo, RBĐ và dịch huyền phù tế bào đều sử dụng các auxin ngoại sinh. Tuy nhiên, auxin có thể có một tác động tiêu cực đến quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Mặc dù chưa được chứng minh, vai trò của auxin trong sự hình thành RBĐ được thừa nhận một cách hiển nhiên.

Trên thực tế, đây là chất duy nhất gia tăng sự hình thành rễ một cách đáng kể khi sử dụng với nồng độ và thời gian thích hợp. Auxin nội sinh do thực vật tổng hợp tồn tại ở dạng tự do và dạng liên kết. Auxin dạng liên kết là auxin tự do liên kết với một amino acid (aspartic acid, glutamic acid) hay glucidic acid. Dạng liên kết này không có hoạt tính auxin nhưng dễ dàng phóng thích auxin nhờ xúc tác của các enzyme. Đây là dạng dự trữ (không bị phá hủy bởi IAA-oxidase) và vận chuyển của auxin. Auxin liên kết là một cơ chế khử độc hay điều hòa hàm lượng auxin tự do. IAA, IBA và NAA là những hợp chất auxin thường được sử dụng để kích thích sự phát sinh rễ.

Để auxin đạt hiệu quả cao nhất, nồng độ sử dụng phải cao cho giai đoạn đầu tiên để khởi động sự phân chia tế bào. Nếu hàm lượng auxin ban đầu quá thấp, sự kích thích tạo rễ sẽ không có hiệu quả đôi khi còn kìm hãm quá trình hình thành rễ. Có ý kiến cho rằng, nên cung cấp một lượng auxin nhất định theo chu kỳ trong suốt quá trình nuôi cấy tạo rễ.

Trong quá trình hình thành RTC, đa số các nhà nghiên cứu đều đồng ý rằng auxin là tín hiệu mở khóa cho sự khởi tạo và phát triển của RTC, cũng đã có rất nhiều bằng chứng làm sáng tỏ vai trò của auxin trong quá trình hình thành RTC. Con đường dẫn truyền auxin đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa dòng phytohormone giữa nguồn IAA và các mô bên trong, điều này tác động lên sự phát triển RTC.

Các đột biến làm gián đoạn con đường vận chuyển auxin ở cây A. thaliana cũng làm thay đổi cấu trúc của RTC như đột biến gen tir3 gây giảm các cực vận chuyển auxin dẫn tới giảm số lượng RTC. Tại cấu trúc rễ đột biến thiếu mô phân sinh chồi đã làm mất đi tính hướng ngọn trong quá trình phát triển do những sai sót trong việc hình thành nhu mô lá dẫn tới thiếu hụt IAA cần cho việc tạo RTC.

Các đột biến alf4 gây sai sót trong việc khởi tạo RTC ở cây non, còn đột biến alf3 có quá trình khởi tạo RTC xảy ra bình thường với việc tạo ra protein ALF3 cần để sinh tổng hợp indole (tiền chất của IAA). Kiểu hình tương phản của các đột biến alf3 và alf4 cho thấy rằng IAA cần cho hàng loạt các giai đoạn phát triển của RTC.

Khi nghiên cứu các đột biến trong cấu trúc rễ bị biến đổi gen, AUX1 được cho là chất mang trong dòng vận chuyển auxin nhờ tác dụng ngăn chặn sự vận chuyển phytohormone giữa nguồn IAA vào mô bên trong và dẫn tới làm giảm 50% số RTC. Nguyên nhân cho việc giảm số lượng RTC của dòng aux1 không liên quan đến tín hiệu khởi tạo RTC của auxin nhưng làm giảm tỷ lệ khởi tạo RTC.

Điều này có thể do quá trình khởi tạo RTC còn chịu tác động của lượng nitric oxide (NO) tạo ra trong quá trình vận chuyển auxin. Vận chuyển auxin phân cực cho phép các tế bào rễ đáp ứng lại với các kích thích của môi trường. IAA vận chuyển từ các lá đang phát triển đến hệ thống rễ thông qua các bơm có chu kỳ sống ngắn trong rễ, điều này đóng vai trò rất quan trọng khi khởi tạo RTC sơ cấp trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển cây con.

Giai đoạn hình thành RTC sơ cấp thường bị ức chế khi cắt đi mô phân sinh đỉnh hay do việc sử dụng tiền chất naphthylphthalamic acid (NPA) dùng để nhận diện các bơm IAA trong rễ nên gây ức chế sinh tổng hợp auxin, nhưng NPA ở liều cực thấp lại có tác dụng khởi tạo RTC sơ cấp. Dựa vào đây, mô hình hình thành RTC của cây con được chia thành hai giai đoạn: pha khởi tạo RTC dựa vào nguồn IAA ở chóp rễ và pha khởi tạo RTC dựa vào việc vận chuyển auxin từ lá. IAA đi vào các tế bào thông qua các kênh hấp thụ auxin được mã hóa trên gen aux1. Gần đây, nhiều bằng chứng cho thấy rằng AUX1 thực hiện chức năng vận chuyển auxin theo hai hướng trong đầu rễ, vận chuyển hướng lên ngọn và hướng xuống rễ trong libe nguyên sinh và các tế bào đầu rễ tương ứng.

Auxin không được vận chuyển theo mô dẫn truyền mà đi xuống từ tế bào này sang tế bào khác, sự di chuyển một chiều và có lẽ do sự vận chuyển tích cực và đòi hỏi năng lượng. Ở thân, auxin di chuyển từ đỉnh ngọn thân xuống phần gốc, trong khi ở rễ, sự di chuyển hướng từ ngọn rễ đến thân. Con đường vận chuyển auxin ở các tế bào thực vật diễn ra thông qua các phức mang vận chuyển ra ngoài nhạy cảm với các chất ức chế sinh tổng hợp auxin như NPA (một số hợp chất được biết tới là có ít nhất hai chuỗi polypeptide).

Polypeptide đầu tiên của các chất mang này là chất vận chuyển gắn trên màng tế bào được mã hóa bởi nhóm gen tổng hợp protein PIN. Các protein PIN định vị bất đối xứng trên màng plasma đóng vai trò kiểm soát sự phân cực của việc vận chuyển auxin.

Rất nhiều trình tự của nhóm gen tổng hợp protein PIN trong cây A. thaliana có chứa nhiều chất mang auxin với các biểu hiện riêng biệt. Polypeptide thứ hai của phức hợp chất mang auxin ra ngoài biểu hiện hoạt động như một tiểu đơn vị điều hòa và điểm gắn kết với các chất ức chế dòng auxin in vitro.

Các protein gắn kết với NPA dường như là một polypeptide riêng biệt từ protein PIN vì chúng có liên kết với màng tế bào ngoại vi và nằm ở tế bào chất. Các protein gắn kết với NPA cũng là các hợp chất điều hòa nội sinh như flavonoid. P-glycoprotein ABCB19/PGP19 là thành viên của các gen kháng thuốc được xác định có ba thành phần tích cực lên chất mang auxin ra ngoài.

Điều này thể hiện mối tương tác giữa PIN1 và ABCB19/PGP19 trong màng plasma làm tăng tỷ lệ và độ đặc hiệu của dòng chảy auxin và sự tương tác này làm giảm chu kỳ năng lượng của PIN1 và có chức năng ổn định PIN1 trong màng plasma.

2.3.4. Tương tác giữa auxin và cytokinin

Quá trình hình thành RTC rất phức tạp phụ thuộc vào nhiều vấn đề như các yếu tố tự nhiên được điều hòa bởi các phytohormone khởi tạo RTC nhưng chưa được biết rõ. Tuy nhiên, áp dụng các thành tựu của công nghệ di truyền phân tử ở cây mô hình A. thaliana đã làm tăng khả năng tìm ra các yếu tố mới và chủ chốt trong con đường khởi tạo RTC.

Đến nay, các con đường truyền tín hiệu bởi phytohormone trở nên rõ ràng và thể hiện vai trò thiết yếu trong việc khởi tạo và hình thành mầm RTC và nhiều nghiên cứu cho rằng việc kiểm soát hình thành RTC sẽ dễ dàng hơn nếu phân tích mối tương tác giữa các phytohormone hơn là tập trung vào tác động của một phytohormone riêng biệt của auxin.

Nồng độ auxin và cytokinin dọc theo rễ chính được cho là điều hòa việc khởi động, hình thành mô phân sinh và phát sinh các mầm RTC. Ví dụ, trong các rễ đậu được tách bỏ hoạt động trụ bì phụ thuộc vào tỷ lệ auxin/cytokinin ngoại sinh, các kết quả cho thấy riêng auxin giúp tăng cường khởi tạo RTC, còn cytokinin có nhiệm vụ hình thành một loạt dãy trụ bì và kết hợp với các phytohormone sắp xếp thượng tầng chức năng. 

Gần đây, auxin được cho là yếu tố gián tiếp điều hòa âm rất nhanh dòng cytokinin bằng cách ngăn chặn quá trình sinh tổng hợp thông qua con đường độc lập với isopentenyladenosine-5’-monophosphate. Ngược lại, khi gia tăng quá mức cytokinin làm toàn bộ dòng auxin ở thực vật di chuyển chậm hơn.

2.3.5. Nhiệt độ

Nhiệt độ cao kích thích sự biến dưỡng của tế bào, thích hợp cho sự khởi tạo sơ khởi rễ. Người ta cho rằng, nếu nuôi cấy ra rễ trong điều kiện sáng thì nhiệt độ kích thích ra rễ là 30-35C, còn nếu nuôi trong điều kiện tối thì nhiệt độ khoảng 20-25ºC là thích hợp.

2.3.6. Ánh sáng

Ánh sáng thường được cho là tác nhân ức chế sự hình thành rễ, đặc biệt là ở giai đoạn hình thành sơ khởi rễ. Điều kiện tối có lợi cho giai đoạn đầu của quá trình ra rễ.

Chu kỳ tối thích hợp là 3-10 ngày tùy thuộc vào loài thực vật khác nhau. Chất lượng ánh sáng có thể ảnh hưởng lên sự ra rễ, ánh sáng trắng kích thích sự ra rễ dưới thông qua vai trò của các phytochrome. Trong đó, với các ánh sáng đơn sắc, ánh sáng đỏ thích hợp cho sự ra rễ, trong khi ánh sáng đỏ xa lại có tác động ức chế sự hình thành RTC.

Ánh sáng xanh không ảnh hưởng đến số lượng rễ tạo thành nhưng làm gia tăng sự kéo dài rễ. Nguyên nhân là do ánh sáng xanh thúc đẩy sự phân hủy IAA nhờ tăng cường tổng hợp các phenylalanin và một số phenol mạch đơn.

2.3.7. Giá thể nuôi cấy

Có thể nói sự tăng trưởng của rễ chịu ảnh hưởng bởi cấu trúc và thành phần của giá thể nuôi cấy. Agar là một dẫn xuất của rong biển, là một hợp chất polysaccharide cao phân tử.

Agar được sử dụng như một nhân tố làm đông trong hầu hết môi trường dinh dưỡng. Vì agar liên kết với nước và hấp thu các hợp chất từ môi trường nên người ta nghĩ rằng, agar hạn chế sự hấp thu các chất điều hòa tăng trưởng. Agar có thể có những ảnh hưởng về vật lý như hạn chế sự kéo dài rễ, và rễ trở nên dày hơn nhờ sự trương phồng, tỏa tròn của tế bào.

Ở cây Radiate pine, cây con kéo dài rễ trong môi trường agar: rễ khô héo và hóa đen khi chuyển ra đất. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, RTC có khuynh hướng phát triển hướng lên bề mặt thạch để hấp thu không khí ở bên trên. Gelrite là các polymer sinh học tinh chiết từ nuôi cấy vi khuẩn Sphingomonas elodea Gelrite hay Phytagel là các tạo ra gel cứng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với agar hoặc agarose. Chúng cũng gần như trong suốt giúp dễ dàng quan sát hơn, ví dụ như để xác định ô nhiễm ở giai đoạn đầu. Tuy nhiên, những loại gel này có xu hướng bị lỏng sau một thời gian dài do sự thay đổi độ pH hoặc sự cạn kiệt các muối cần thiết cho các liên kết. 

Khả năng mẫu tiếp xúc với môi trường này tối ưu hơn so với agar, nên thông thường mẫu sẽ phát sinh hình thái như tạo mô sẹo xốp tốt hơn. Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại cho thấy hiệu quả tiêu cực của chúng lên sự phát triển của mẫu cấy. 

Để có độ thoáng khí cao trong nuôi cấy một số nghiên cứu đã sử dụng giá thể bông gòn, có nguồn gốc từ bông cây Gossypium herbaceum, trơ về mặt hóa học.Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về hiệu quả của bông gòn trong nuôi cấy mô. 

Theo nghiên cứu của Trịnh Thị Hương (2017), bông gòn cũng có thể sử dụng để nuôi cấy rễ chuyển gen sâm Ngọc Linh, nhưng hiệu quả không cao bằng agar.

2.3.8. Các hệ thống nuôi cấy

Các hệ thống lắc theo quỹ đạo bao gồm các bình tam giác đặt trên một máy lắc tạo ra các chuyển động tròn. Bằng cách điều chỉnh các kẹp bên trên, người ta có thể sử dụng chúng để lắc các bình nuôi cấy có thể tích từ 50-2000 mL. Các máy lắc quỹ đạo thường có tốc độ thay đổi trong khoảng 30-150 vòng/phút. Nhìn chung, tốc độ lắc trên 200 vòng/phút là không phù hợp cho nuôi cấy thực vật.

Nhịp của máy lắc nên được điều chỉnh ở khoảng 1,9 và 3,8 cm theo quỹ đạo chuyển động. Tốc độ lắc tối ưu (dựa vào tốc độ tăng trưởng, tổng lượng tế bào và khả năng phân tách tế bào tốt nhất) tùy thuộc vào từng trường hợp nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, bình nuôi cấy và lượng thể tích nuôi cấy tương quan với kích thước và hình dạng bình. Nuôi cấy các rễ bất định thường sử dụng 20-25 mL môi trường trong bình thể tích 100 mL hoặc 70 mL môi trường trong bình thể tích 250 mL. 

Các hệ thống nuôi cấy khuấy hoặc sục khí được sử dụng để nuôi cấy mẻ lớn (thể tích 5-10 L). Trong những hệ thống này, tế bào được duy trì và phân bố trong suốt quá trình nuôi cấy, sự trao đổi khí được thúc đẩy nhờ sự thoáng khí do áp lực và sự thoáng khí bên trong do môi trường bị khuấy động nhờ từ tính.

Hệ thống nuôi cấy khuấy có thể dễ dàng gắn kết với các thiết bị điều khiển sự tăng trưởng tế bào và thay đổi môi trường nuôi cấy, kết nối với nguồn cung cấp môi trường và nguồn cung cấp khí để thay đổi điều kiện nuôi cấy.

Các hệ thống này có thể được phát triển thành hệ thống nuôi cấy liên tục trong đó nhiệt độ của môi trường nuôi cấy có thể điều khiển được nhờ cuộn dây đốt nóng.

Các hệ thống nuôi cấy tế bào và rễ của P. ginseng đã được thiết kế để so sánh, đánh giá khả năng phát triển và sản xuất saponin trên quy mô lớn. Tổng hàm lượng saponin cụ thể là ginsenoside có nhiều khác biệt trong từng nuôi cấy và trong từng hệ thống thử nghiệm. Trong nuôi cấy rễ, tính chất và thành phần các hợp chất ginsenoside đặc biệt tương tự như trong củ sâm thu ngoài tự nhiên.

Tuy nhiên, tổng hàm lượng saponin chỉ chiếm 1,8% KLK từ bình tam giác lớn và 1,5% trong Bioreactor sinh học, thấp hơn so với tổng hàm lượng saponin trong củ P. ginseng ngoài tự nhiên (3,3% KLK). Tuy nhiên, năng suất thu nhận saponin trong nuôi cấy tế bào P. ginseng rất cao, đặc biệt nuôi cấy huyền phù tế bào trong Bioreactor lên đến 4,3%, trong khi nuôi cấy mô sẹo chỉ đạt 1,3%.

Trong trường hợp nuôi cấy huyền phù tế bào đã phát hiện được một loạt các saponin riêng lẻ khác, trong đó có chứa các ginsenoside Rb1 và Rg1 với hàm lượng sản xuất ra rất cao. Do đó, hệ thống này sẽ phù hợp hơn cho việc sản xuất các hợp chất riêng lẻ. Ngoài ra, do tình trạng biệt hóa khác nhau ở các tế bào thực vật nên gặp khó khăn khi thu nhận các hợp chất mong muốn. 

3. Một số nghiên cứu nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ các loài sâm

3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới

Việc nuôi cấy RBĐ một số loài sâm phương Đông để sản xuất saponin cũng đã có những thành công nhất định. Nuôi cấy RBĐ hay rễ tơ P. ginseng được chú trọng nhiều nhất trong các phương pháp nuôi cấy mô và cơ quan, do các nuôi cấy này thu nhận sinh khối hiệu quả và nhiều nhất trong thời gian rất ngắn.

Hơn nữa, các ginsenoside quý từ P. ginseng cũng chủ yếu tập trung và tích trữ trong rễ P. ginseng cho nên lượng saponin thu được cũng cao hơn hẳn các nuôi cấy khác. So với nuôi cấy rễ tơ chuyển gen hay rễ trồng, nuôi cấy RBĐ cũng có nhiều ưu điểm hơn vì việc quản lý quy trình nuôi cấy rõ ràng, đơn giản hơn và các nuôi cấy cũng ổn định và an toàn hơn. Kể từ năm 1998, hệ thống Bioreactor có cánh khuấy đã được nghiên cứu nhằm thu nhận sinh khối từ nuôi cấy rễ.

Kết quả cho thấy, nuôi cấy rễ được xem như là hiệu quả nhất cho việc sản xuất sinh khối bởi vì chúng sinh trưởng nhanh và sản xuất hợp chất ổn định.

Từ đó đến nay, hệ thống nuôi cấy này đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy RBĐ với số lượng lớn phục vụ cho mục đích thương mại. Hệ thống Bioreactor đặc biệt rất hiệu quả trong nuôi cấy trên quy mô lớn RBĐ P. ginseng.

Đối với các loài sâm, khả năng tích lũy các hợp chất saponin có ý nghĩa rất lớn trong các ngành sản xuất dược phẩm. Do vậy, Hahn và cs (2003) cũng đã xác định các loại và nồng độ auxin tối ưu lên sự hình thành cơ quan và sản xuất saponin từ nuôi cấy RBĐ P. ginseng C.A. Meyer. Rễ và chồi phát triển trong môi trường có chứa 2,4-D, NAA và đặc biệt là IBA có sự gia tăng hàm lượng các ginsenoside nhóm Rb hơn là nhóm Rg. Palazon và cs (2003) đã tiến hành bước đầu sản xuất ginsenoside từ nuôi cấy rễ tơ P. ginseng trong Bioreactor cải tiến.

Ngoài ra, hệ thống Bioreactor hình cầu thể tích từ 500-1000 L cũng được sử dụng trong nghiên cứu này để sản xuất ginsenoside. Hệ thống nuôi cấy Bioreactor đã đạt đến thể tích 10000 L tại Hàn Quốc. Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung oxygen lên sự phát triển tế bào và sản xuất saponin trong nuôi cấy Bioreactor của P. ginseng cho thấy bổ sung oxygen cho nuôi cấy P. ginseng trong hệ thống Bioreactor là cần thiết cho sự phát triển của tế bào và tích lũy saponin.

Ngoài ra, nuôi cấy RBĐ còn phụ thuộc vào CO2 vì CO2 tác động lên enzyme chống oxy hóa và giúp sản xuất ginsenoside ở nuôi cấy lỏng rễ P. ginseng. Theo kết quả quan sát được, nồng độ enzyme chống oxy hóa gia tăng có thể ảnh hưởng đến phản ứng chống lại sự tổn hại tế bào bởi CO2 .

Như vậy, sự gia tăng nồng độ CO2 có thể ảnh hưởng không tốt cho tích lũy ginsenoside; tuy nhiên, nó làm giảm stress và giúp rễ phát triển. Nuôi cấy RBĐ còn chịu tác động của các điều kiện nuôi cấy: pH, đường, nitrogen, phosphate, nhưng đây không phải là các tác nhân ảnh hưởng đến sự phát triển của rễ, mà còn chịu ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng saponin.

Ví dụ, hàm lượng saponin cao nhất thu được khi nuôi cấy RBĐ cây P. ginseng ở pH 5,8. Nghiên cứu thu nhận sinh khối rõ ràng không chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm mà đã được công nghiệp hóa bằng nuôi cấy Bioreactor. Tình hình nghiên cứu về tái sinh và đặc biệt là thu nhận sinh khối thông qua nuôi cấy in vitro đã có một bước tiến rất dài, nguồn sinh khối thu được đã góp phần làm giảm việc khan hiếm nguyên liệu cho các ngành dược phẩm và mỹ phẩm. 

3.2. Một số nghiên cứu trong nước về rễ bất định sâm Ngọc Linh

Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu về RBĐ sâm Ngọc Linh, tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về RTC và những nghiên cứu về nuôi cấy rễ loài sâm này còn rất hạn chế.

Dương Tấn Nhựt và cs (2009) đã bước đầu thành công trong việc nhân nhanh RBĐ của sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha et Grushv.) và các khảo sát về một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh khối cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro và bước đầu phân tích hàm lượng saponin cũng đã được thực hiện. Dương Tấn Nhựt và cs (2012) cũng đã xây dựng được một hệ thống nuôi cấy phù hợp để tái sinh RBĐ cây sâm Ngọc Linh.

Gần đây, hàng loạt các nghiên cứu trong nước cũng đã tập trung vào tối ưu hóa các yếu tố môi trường dinh dưỡng, các điều kiện nuôi cấy và giá thể nhằm tăng sinh khối RBĐ sâm Ngọc Linh. Hồ Thanh Tâm và cs (2013) đã xác định được trong các loại auxin, IBA ở nồng độ 5 mg/L là phù hợp để RBĐ hình thành từ mẫu lá với lượng saponin cao hơn so với sử dụng các auxin khác. 

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng cho rằng môi trường phù hợp cho nuôi cấy rễ sâm Ngọc Linh là môi trường SH hay MS chứa 5 mg/L IBA 

4. Elicitor và sự kích kháng trong nuôi cấy in vitro

Để tăng hiệu quả sản xuất saponin, gần đây mối tương quan giữa sản xuất saponin và biểu hiện của enzyme quan trọng trong sinh tổng hợp saponin đã được nghiên cứu trên các chi P. ginseng thông qua tác động của các elicitor.

4.1. Khái niệm elicitor là gì?

Elicitor (elicitor thực vật) có thể được định nghĩa là một chất làm các thay đổi sinh lý trong thực vật. Khi đưa vào hệ thống tế bào sống của thực vật, các tế bào thực vật phản ứng với các tác nhân gây stress này bằng cách hoạt hóa một loạt các cơ chế tương tự như phản ứng phòng vệ của thực vật với các tác nhân gây bệnh hay kích thích của môi trường, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của thực vật và tăng cường tổng hợp các hợp chất thứ cấp.

Lần đầu tiên, các elicitor sinh học được mô tả vào đầu những năm 1970; kể từ đó, hàng loạt các công bố đã chứng minh các hợp chất có nguồn gốc từ các tác nhân gây bệnh gây ra các phản ứng phòng vệ hoặc cảm ứng chống chịu ở thực vật và gây tích lũy một số hợp chất sinh học ở cây trồng hay trong các nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Việc ứng dụng các elicitor riêng lẻ hay kết hợp ở các thời điểm sinh trưởng của thực vật như một công cụ để tăng cường hàm lượng các hợp chất thứ cấp, nhưng đây không phải là thuốc bảo vệ thực vật hay phân bón dùng để kích thích sự phát triển của cây trồng. Sự kích kháng là gây đáp ứng phòng vệ bằng một lượng nhỏ các elicitor để tăng cường quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp.

4.2. Phân loại elicitor

Elicitor có thể được phân loại dựa trên cơ sở bản chất tự nhiên có elicitor phi sinh học, elicitor sinh học. Elicitor sinh học (chitosan, alginate, cellulose,…) thường bắt nguồn từ các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) hay các tác nhân lây nhiễm từ động vật như các polysaccharide, polyamine, glycoprotein và acid béo.

Các elicitor từ thành tế bào vi sinh vật (cell-wall elicitor) thường là các thành phần hoạt hóa ở mức độ phân tử. Các elicitor sinh học (galacturonide hay hepta-β-glucoside) được giải phóng ra khi thực vật bị tấn công thông qua hoạt động của các enzyme chống lại các tác nhân gây bệnh.

Các hormone thực vật như salicylic acid (SA), jasmonate hay jasmonic acid (JA),… được tổng hợp hóa học hoặc chiết xuất từ thực vật được xếp vào nhóm elicitor sinh học có thể tách riêng thành nhóm các elicitor dẫn truyền tín hiệu (signal elicitor).

SA, JA, methyl jasmonate (MeJA) và abscisic acid (ABA) là các elicitor phổ biến gây cảm ứng biểu hiện gen ở thực vật thông qua các con đường chuyển hóa sinh học khác nhau, và được định nghĩa là các hormone bởi các phản ứng của tế bào ở các nồng độ rất thấp, cho nên tùy mục đích mà các elicitor này được ứng dụng theo các cách khác nhau.

Ví dụ: có thể sử dụng 0,01 hay 0,1 mM MeJA ở dạng khí trong phòng nuôi kín hay dạng lỏng trong dung dịch thủy canh để tăng cường các hợp chất ginsenoside trong nuôi cấy P. notoginseng. Elicitor phi sinh học được sản sinh bởi các tác nhân gây stress từ môi trường. Các tác nhân này có thể có bản chất từ hóa học như các muối vô cơ, các ion kim loại,… có khả năng phá vỡ tính toàn vẹn của tế bào và các tác nhân vật lý (tia UV, vết thương, nhiệt độ,…) như đặt cây súp lơ hay củ cải 3 ngày tuổi dưới điều kiện chiếu sáng với cường độ cao 700 µmol.m-2 .s -1 hay để ở 4C trong 1 ngày làm hàm lượng tổng phenolic tăng lên.

Ngoài phân loại theo bản chất, có thể phân loại elicitor theo nguồn gốc phát sinh ra gồm elicitor nôi sinh và ngoại sinh. Các elicitor cũng được phân loại dựa vào mối tương tác với cây chủ như các “elicitor phổ cập”, các carbohydrate, protein thành tế bào, oligosaccharide gây ra các cơ chế cảm ứng phòng vệ không đặc hiệu trong nuôi cấy và “các elicitor chuyên biệt” từ nấm, vi khuẩn hay bắt nguồn từ thực vật chỉ đặc hiệu với một cây chủ, tương ứng với gen gây đề kháng chỉ có ở cây chủ đó để chống lại tác nhân này.

4.3. Cơ chế tác động của các elicitor

Các elicitor có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây nên các đáp ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh ra ở thực vật khi chịu tác động của các tác nhân gây bệnh). Việc thực hiện gây kích kháng các cây P. ginseng bởi các elicitor gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ giúp bảo vệ cây, đồng thời làm tăng sự tích lũy các hợp chất saponin trong nuôi cấy in vitro.

Mặc dù đã có những nghiên cứu sâu về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật; tuy nhiên, cơ chế tác động của các elicitor này vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có nhiều giả thuyết đã được đưa ra để giải thích tác động của elicitor thông qua mạng lưới truyền tín hiệu phức tạp như cơ chế truyền tín hiệu Ca2+, các yếu tố ảnh hưởng đến sự nguyên vẹn của màng tế bào, con đường ức chế/hoạt hóa nội bào hay thay đổi áp suất thẩm thấu.

Khi G-protein tham gia vào đáp ứng phòng vệ ở thực vật nhờ sự bắt cặp với các thụ thể để gián tiếp truyền tín hiệu elicitor đến các effector, như các kênh ion và các phospholipase, sau đó truyền tín hiệu đến các phản ứng xuôi dòng để sản sinh các hợp chất biến dưỡng thứ cấp.

Sự kiềm hóa môi trường (hay apoplast) là một trong những đáp ứng từ rất sớm xảy ra khi nuôi cấy tế bào thực vật khi được xử lý với các elicitor.

Sự acid hóa tế bào chất tương ứng được quan sát cùng với sự kiềm hóa môi trường.

Sự acid hóa tế bào chất đóng vai trò như là một bước thiết yếu trong con đường truyền tín hiệu, dẫn đến sự sản sinh chất oxy hóa và sinh tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp.

Dòng ion được cảm ứng bởi elicitor là một đáp ứng tức thời của tế bào thực vật, xảy ra chỉ trong vòng 5 phút sau khi xử lý. Dòng ion như sự trao đổi K+ /H+ , dòng Clđi ra và dòng Ca2+ đi vào như là những đáp ứng sớm nhất của tế bào thực vật đối với những tác nhân không độc hay các elicitor. Trong số những dòng ion này, dòng ion Ca2+ đi vào hoạt động như là một đáp ứng quan trọng nhất vì Ca2+ là một tín hiệu thứ cấp đối với rất nhiều sự thay đổi sinh lý và tiến trình tế bào khác nhau.

Có thể nói, dòng Ca2+ được cảm ứng bởi elicitor là một trong những đáp ứng sớm nhất và hoạt động như một thông tin tín hiệu kiểm soát hầu hết mọi phản ứng xuôi dòng. Vì vậy, dòng Ca2+ được cảm ứng bởi elicitor đóng một vai trò quan trọng đối với sự tích lũy các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật.

Một số giả thiết cho rằng có sự liên kết giữa elicitor với các thụ thể trên màng plasma để kích hoạt quá trình san xuất hợp chất thứ cấp. Ca2+ gắn vào màng nguyên sinh chất từ môi trường bên ngoài tế bào và nguồn Ca2+ bên trong tế bào.

Một số tác giả nhấn mạnh đến sự thay đổi nhanh quá trình phosphoryl hóa protein và kích hoạt protein kinase chính là cơ chế tác động của các elicitor. Trong khi đó, nhiều tác giả khác nhận thấy có sự tích lũy mitogen-activated protein kinase (MAPK) và kích hoạt G-protein trong quá trình kích thích tổng hợp các saponin ở P. ginseng. Hu và cs (2004) cho thấy, các hoạt động gây ra bởi chitosan (CHN) lên MAPK cần cho việc tổng hợp saponin. EGTA và LaCl3 đã ức chế hoạt động MAPK 39 kD và 42 kD. Những kết quả này còn chỉ ra rằng, sự gia tăng Ca2+ nội bào do CHN gây ra là cần thiết cho sự tổng hợp saponin bao gồm tăng hoạt tính của NADPH oxidase và sản sinh H2O2 gây ức chế phản ứng oxy hóa. Ngoài ra, elicitor còn bất hoạt H+ – ATPase, làm giảm sự phân cực của màng, tăng pH bên ngoài màng. Việc sản xuất các ROS (reactive oxygen species) như anion superoxide và H2O2 tạo ra hiệu ứng kháng khuẩn trực tiếp cũng như góp phần tạo ra các dẫn xuất của acid béo có hoạt tính sinh học.

Tương tự, ROS tham gia vào quá trình liên kết với protein giàu proline gắn trên thành tế bào sau đó hoạt động như một tín hiệu thứ cấp và kích hoạt dịch mã các gen phòng vệ. Sự suy giảm phosphoinositide được cảm ứng bởi elicitor xảy ra ở nhiều loài thực vật khác nhau.

Một trong những con đường vòng phosphatidylinositol quan trọng là sự thủy phân phosphatidyl inositol 4,5-diphosphate nhờ phospholipase C. Enzyme này có thể được hoạt hóa nhờ Ca2+ từ khoang dự trữ calcium nội bào như mạng lưới nội chất, thể golgi hay không bào ở thực vật.

Vì vậy, con đường truyền tín hiệu IP3-Ca2+ được cho là đóng vai trò trung gian trong sự sản sinh phytoalexin được cảm ứng bởi elicitor. Sự gia tăng hoạt tính PLC hay IP3 trong tế bào chất của tế bào thực vật đáp ứng lại với việc xử lý elicitor là cần thiết đối với sự tích lũy một số hợp chất biến dưỡng thứ cấp có khả năng phòng vệ.

Một nhóm thông tin tín hiệu thứ cấp khác, các nucleotide vòng như cAMT hay cGMP, cũng đóng vai trò quan trọng trong sự tích lũy các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở một số tế bào thực vật đáp ứng với elicitor. Nhiều bằng chứng sinh lý, sinh hóa và di truyền đã cho rằng cAMP hay cGMP đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa các kênh cation trên màng plasma của tế bào thực vật đáp ứng lại với elicitor hay các tác nhân gây stress khác và những kênh cation cổng nucleotide vòng này đóng vai trò rất quan trọng trong đáp ứng phòng vệ ở thực vật.

Theo các giả thuyết khác, sự tích lũy các protein liên quan đến việc bảo vệ tế bào khỏi tác nhân gây bệnh như chitinase và glucanase, endopolygalacturonase giúp giải phóng các tín hiệu pectic oligomer (elicitor nội sinh), glycoprotein giàu hydroxyproline và chất ức chế protease. Kích hoạt sự phiên mã của các gen phòng vệ cũng đã được công bố trên các đối tượng là P. ginseng.

Ngoài ra, ethylene và nitric oxide (NO) cũng đóng vai trò như một trong những tín hiệu đáp ứng miễn dịch trong phản ứng phòng vệ của thực vật. 

Rõ ràng, con đường truyền tín hiệu ethylene cần thiết cho phản ứng phòng vệ của thực vật chống lại stress nhưng chỉ có rất ít trường hợp tích lũy các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật chịu ảnh hưởng bởi ethylene. Nồng độ ethylene trong nuôi cấy phải có một giá trị tới hạn để hoạt động bởi ethylene ở nồng độ cao có thể ức chế quá trình sinh tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp; trong khi ở nồng độ thấp, ethylene thúc đẩy sự sản sinh các hợp chất biến dưỡng thứ cấp được cảm ứng bởi elicitor. 

Nitric oxide (NO) được biết đến là một hợp chất tín hiệu ở thực vật. NO hoạt động như một tín hiệu cho sự tăng trưởng, phát triển và phòng vệ của thực vật. Nghiên cứu quá trình phiên mã cho thấy, NO cảm ứng các gen phòng vệ và các gen thành phần truyền tín hiệu liên quan đến các tác nhân gây bệnh và stress, điều này đã chỉ ra rằng con đường truyền tín hiệu NO có liên quan đến quá trình sản sinh các hợp chất biến dưỡng thứ cấp.

4.4. Cách xử lý và tác động của elicitor

Tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật thông qua vai trò của các elicitor đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong công nghiệp dược phẩm. Các tham số như thành phần và nồng độ elicitor, thời gian xử lý, tuổi nuôi cấy, dòng tế bào, phytohormone, thành phần dinh dưỡng và đặc điểm thành tế bào phù hợp có thể tăng khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp.

4.4.1. Nồng độ elicitor

Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Sự tích lũy ajmalicine cao hơn trong nuôi cấy cây dừa cạn được xử lý bằng dịch chiết Trichoderma viride, Aspergillus niger và Fusarium moniliforme với các nồng độ khác nhau. Sự tích lũy ajmalicine trong các tế bào được xử lý nồng độ elicitor cao (5%) cao hơn so với xử lý ở nồng độ thấp (0,5%). Tuy nhiên, nồng độ elicitor cao hơn 10% ảnh hưởng bất lợi lên sự tích lũy ajmalicine. Nồng độ elicitor cao gây ra hiện tượng đáp ứng quá ngưỡng, dẫn đến chết tế bào.

Ngoài ra, khi bổ sung JA, YE và CHN ở các nồng độ khác nhau sẽ có tác động khác nhau lên khả năng tích lũy azadirachtin trong nuôi cấy tế bào Azadirachtin indica; JA và YE ở nồng độ cao (100 mg/L) giúp tích lũy hợp chất này tối ưu hơn ở nồng độ thấp, nhưng CHN ở nồng độ thấp (50 mg/L) lại cho năng suất tích lũy cao hơn khi tăng nồng độ lên, trong đó YE cho kết quả tốt nhất.

4.4.2. Thời gian tiếp xúc với elicitor

Sản xuất ajmalicine tăng khoảng 3 lần khi tế bào dừa cạn được xử lý với dịch chiết của T. viride trong 48 giờ, và tăng 2 lần khi xử lý với dịch chiết của A. niger và F. moniliforme. Tuy nhiên, thời gian tiếp xúc cao hơn 96 giờ làm giảm ajmalicine tích lũy. Ngoài ra, thời gian tiếp xúc khác nhau cũng tác động lên khả năng tích lũy các saponin ở nhân sâm.

4.4.3. Thời kỳ nuôi cấy

Thời điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học nhờ tác động của các elicitor. Kết quả sản xuất ajmalicine từ tế bào dừa cạn cho thấy ajmalicine cao nhất (166 µg, dw) được tích lũy trong tế bào 20 ngày tuổi được xử lý với dịch chiết của T. viride.

4.4.4. Thành phần dinh dưỡng

Thành phần môi trường cũng đóng một vai trò quan trọng để tăng cường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp khi xử lý với elicitor. Sự tích lũy ajmalicine trong môi trường Zenk tăng nhiều hơn so với môi trường MS. Ngoài ra, ảnh hưởng của elicitor cũng còn phụ thuộc vào đặc tính của chúng, dòng tế bào, dòng vi sinh vật sử dụng làm elicitor, sự có mặt của các CĐHST, thành phần dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy,. 

4.5. Một số elicitor phổ biến trong nuôi cấy nhân sâm

4.5.1. Chitosan

Chitosan (CHN) là một elicitor ngoại sinh hay một elicitor sinh học có nguồn gốc từ thành tế bào của động vật giáp sát, thuộc dạng deacetyl hóa của chitin.

Chitin là một polysaccharide bao gồm đồng trùng hợp N-acetyl-D-glucosamine và các tiểu phần D-glucosamine liên kết với nhau nhờ cầu nối -1,4 glycosidic. Chitin hiện diện ở rất nhiều loài như trong vỏ của các loài giáp xác, trong lớp vỏ cutin của côn trùng và trong vách tế bào của nấm và một vài loài tảo.

CHN là một polymer sinh học có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực xử lý nước thải, công nghiệp giấy và bột giấy, trong các loại dược phẩm và đồ trang sức, trong công nghệ sinh học, thực phẩm, thức ăn gia súc và các loại màng sinh học. Trong những nghiên cứu gần đây, một ảnh hưởng tích cực của CHN đã được ghi nhận trên sự phát triển của rễ, chồi và lá của nhiều loài thực vật như cây hoa đồng tiền và nhiều cây trồng khác.

Ngoài ra, CHN còn được biết đến như một elicitor sinh học với khả năng gây ra các phản ứng oxy hóa khử và phòng vệ ở thực vật và giúp kích thích khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp.

Ví dụ, CHN giúp hoạt hóa các mitogen-activated protein kinase (MAPK) như squalene synthase, ginseng squalene epoxidase (của các gen gss và gse), hay β-Amyrin synthase (β-AS), từ đó làm tăng khả năng sinh tổng hợp ra các saponin

4.5.2. Dịch chiết nấm men

Dịch chiết nấm men (Yeat extract – YE) cũng là một elicitor ngoại sinh có nguồn gốc sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae, trong đó YE chứa hàng loạt thành phần có thể kích thích phản ứng phòng vệ thực vật và dẫn đến sự gia tăng các hợp chất thứ cấp như chitin, N-acetylglucosamine oligomers, β-glucan, glycopeptides và ergosterol.

Trong tự nhiên, có rất nhiều vi sinh vật có ích cho sự phát triển và tích lũy các hợp chất saponin quý trong rễ, do vậy các vi sinh vật này là rất cần thiết cho cây.

Các hợp chất phenol có thể tương tác với protein giàu proline của YE để tạo ra chất kết dính, có khả năng tương tác với protein đã dẫn tới tầm quan trọng của chúng trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và nông nghiệp. Ứng dụng YE ngày càng trở nên rộng rãi bởi những đặc tính có lợi của YE như làm tăng sản lượng và năng suất sản phẩm của cây đậu nành.

Hơn nữa, YE còn có ích cho thực vật tăng trưởng và sinh sản thông qua việc cải thiện sự hình thành hoa và một số cây trồng do hàm lượng auxin và cytokinin cao và tăng cường tích lũy carbohydrate. Xử lý lá với YE còn làm tăng tỷ lệ đạm và thành phần carbohydrate trong cây. YE có tác dụng kích thích đối với sự phân chia và gia tăng tế bào, tổng hợp protein, nucleic acid và sự hình thành chlorophyll. 

YE còn có chứa chất bảo vệ, tức là đường, protein, amino acid, cũng như một số vitamin cải thiện sự tăng trưởng, ra hoa và kết quả của một số cây trồng bằng cách nuôi cấy lá với chiết xuất từ nấm. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu cho thấy YE cũng có tác dụng như cytokinin giúp kích thích khả năng nảy chồi cây đậu. 

Vai trò của YE tuy chưa được ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy sâm Ngọc Linh, nhưng đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy thực vật. Khi bổ sung 250 và 500 mg/L YE đã làm tăng đáng kể lượng noradrenaline trong nuôi cấy rễ tơ Portulaca oleracea L.

4.5.3. Elicitor có nguồn gốc từ chất điều hòa sinh trưởng thực vật Salicylic acid

Salicylic acid (SA) là một elicitor nội sinh hay elicitor sinh học có nguồn gốc là các hormone nội sinh, được biết nhiều nhất với vai trò là một chất cảm ứng truyền tín hiệu đến trong hệ thống kháng tạp nhiễm ở thực vật. SA nhanh chóng được tích lũy ở vị trí bị xâm nhiễm trong suốt quá trình tấn công của tác nhân gây bệnh và nó lan sang những phần khác của cây để cảm ứng đáp ứng phòng vệ trên diện rộng.

Đồng thời, SA cảm ứng sự biểu hiện gen liên quan đến sinh tổng hợp và sản sinh một số hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật. Jasmonic acid Jasmonic acid (JA) là một elicitor nội sinh trong nhóm elicitor sinh học có nguồn gốc là các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐSTTV) có tiềm năng thương mại cao, có tác động truyền tín hiệu kích thíc mạnh phản ứng phòng vệ, làm ức chế sinh trưởng và phát triển thực vật. JA được xem là “hormone” bởi vì chúng gây ra những phản ứng của tế bào ở nồng độ thấp.

Hàm lượng JA trong thực vật thông thường khoảng 0,01-3 ng/g trọng lượng tươi (FW). JA được tổng hợp qua con đường octadecanoid, bắt đầu từ acid linolenic và kết thúc ở (+)-7-epi-JA (các thể tiếp hợp và đồng phân của chúng).

Từ lâu, JA đã được xem như là những hợp chất chuyển đổi các tín hiệu elicitor để sản sinh các hợp chất biến dưỡng thứ cấp. Jasmonic acid (JA) và nhiều dẫn xuất khác như MeJA, HEJ,… là các tín hiệu JA ngoại sinh được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào và cơ quan thực vật gây kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, hình thành cơ quan dự trữ, cảm ứng hệ thống bảo vệ chống lại các stress sinh học (động vật ăn cỏ và các mầm bệnh) và phi sinh học (hạn hán và ozons), ức chế sự tăng trưởng trong các mô như rễ cây và chồi non.

Ngoài ra, JA có thể tương tác với hormone khác đặc biệt là ethylene làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của thực vật. Các JA chủ yếu được hình thành nhờ quá trình oxy hóa các acid béo chưa bão hòa như linoleic acid, hoạt động cộng hợp với lipase, lipoxygenase hay nhóm cytochrome P450 (CYP74) như allene oxide synthase (AOS) và hydroperoxide lyase (HPL). Hầu hết ở các loài thực vật cảm ứng tích lũy các hợp chất biến dưỡng đều nhờ con đường truyền tín hiệu JA như terpenoid, flavonoid, alkaloid và phenylpropanoid.

Vì vậy, con đường truyền tín hiệu JA đóng vai trò như một tín hiệu không thể thiếu trong quá trình sinh tổng hợp nhiều hợp chất thứ cấp ở thực vật. Khi xử lý JA trong nuôi cấy P. ginseng, nhiều nghiên cứu đã xác định được quá trình sinh tổng hợp các saponin phụ thuộc vào tín hiệu JA gần như hoàn chỉnh trong hoạt hóa quá trình trao đổi chất và các chất trung gian trong con đường sinh tổng hợp saponin.

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, tín hiệu oxylipin JA liên quan đến con đường sinh tổng hợp các cyclonpenenone thông qua con đường octadecanoide hay con đường không qua hệ thống enzyme. Abscisic acid Abscisic acid (ABA) là một elicitor nội sinh hay elicitor sinh học có nguồn gốc là các hormone nội sinh.

ABA hoạt động như một phân tử tín hiệu quan trọng để điều hòa sự biểu hiện các gen phòng vệ. ABA cũng đóng vai trò điều hòa quá trình sinh tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào một số loài thực vật. ABA cũng có thể là một tín hiệu để tích lũy các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở thực vật được cảm ứng bởi stress thẩm thấu. Đôi khi ABA lại làm giảm sự tích lũy một số chất biến dưỡng thứ cấp.

Ngoài ra, còn rất nhiều elicitor ngoại sinh khác như ánh sáng, nhiệt độ, pH,… và elicitor nội sinh khác chiết xuất từ tế bào thực vật có thể tác động lên quá trình tích lũy các hợp chất thứ cấp hay các saponin trong các loài sâm.

4.6. Ứng dụng elicitor trong nuôi các loài nhân sâm in vitro

Tăng cường tổng hợp saponin triterpene được nghiên cứu chủ yếu bằng cách bổ sung các elicitor vào nuôi cấy P. ginseng, P. notoginseng, P. quinquefolium và P. vietnamensis. MeJA ở nồng độ 0,2 mM làm tăng sản xuất các ginsenoside gấp 4 lần trong RBĐ P. ginseng và 1,8-3,1 lần trong nuôi cấy huyền phù tế bào P. ginseng so với đối chứng.Trong phản ứng với 0,2 mM SA, saponin tăng gấp 3 lần trong nuôi cấy RBĐ P. ginseng và HEJ tăng sản lượng ginsenoside gấp 2-4,4 lần trong nuôi cấy huyền phù tế bào.

Hơn nữa, khi nghiên cứu các elicitor sinh học cũng có hiệu quả mạnh lên khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp. Ngoài ra, một số elicitor sinh học khác cũng được ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy P. ginseng in vitro như CHN cũng làm tăng khả năng tích lũy triterpene trong P. ginseng. Hao và cs (2013) xác định trong 38 chủng nấm phân lập được từ rễ P. Ginseng, Fusarium sp. có tiềm năng lớn trong việc gia tăng hàm lượng saponin. Nói chung, sử dụng những elicitor khác nhau để tăng cường sản xuất saponin trong nuôi cấy bằng Bioreactor ít có hiệu quả so với các nuôi cấy ở quy mô nhỏ, nhưng sinh khối thu được lại cao hơn. Wang và cs (2005) đã nghiên cứu sự khác biệt trong sản xuất ginsenoside trong nuôi cấy tế bào sâm Tam thất trong bình tam giác và Bioreactor.

Trong bình tam giác, có sự gia tăng mạnh trong tổng hàm lượng ginsenoside từ ngày 8 đến ngày 15 sau khi cảm ứng tới mức tối đa vào ngày 15 gấp 2,6 lần so với đối chứng. Ngược lại, các tế bào trưởng thành trong Bioreactor đã cho thấy một sự gia tăng chậm trong sản xuất saponin, đạt tối ưu vào ngày 15 tăng gấp 1,8 lần so với đối chứng. Tuy nhiên, tương tự sau 5 ngày bổ sung MeJA ngay từ đầu nuôi cấy và kết hợp với nồng độ sucrose thích hợp cho không những có hiệu quả khi nuôi cấy trong Bioreactor mà còn giúp tăng cường sản xuất các saponin lên gấp 4 lần.

Năm 2005, các nghiên cứu cũng đã cho thấy, hàm lượng saponin trong sâm Triều Tiên (P. ginseng) cũng có thể gia tăng nhờ bổ sung các elicitor vào môi trường lỏng khi nuôi cấy RBĐ hay tăng lượng bilobalide và các ginkolide trong nuôi cấy tế bào cây Ginkgo biloba, cũng như xác định con đường truyền tín hiệu của các elicitor lên khả năng tạo ra các sản phẩm thứ cấp.

Năm 2006, Jeong và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của oxygen, carbon dioxide và ethylene lên sự tăng trưởng và quá trình sản xuất thành phần dược chất trên quá trình nuôi cấy RBĐ sâm Triều Tiên bằng Bioreactor. Thành phần môi trường hay các elicitor cũng tác động đến việc cảm ứng và phát triển rễ tóc, cũng như sản xuất các dược chất từ một số cây dược liệu.

Ali và cs (2008) đã cho thấy, ảnh hưởng của carbon dioxide lên enzyme chống oxy hóa trong sản xuất ginsenoside ở rễ sâm Triều Tiên khi nuôi cấy lỏng. Kim và cs (2005) khi tiến hành nghiên cứu tăng khả năng sản xuất saponin từ RBĐ của sâm Triều Tiên, môi trường lẫn điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến hàm lượng saponin. Xử lý với MeJA hoặc SA thường làm giảm tăng trưởng các mẫu cấy. Đối với nuôi cấy rễ P. ginseng, sinh khối rễ sụt giảm nghiêm trọng khi xử lý hơn 9 ngày với 0,2 mM MeJA hoặc SA.

Ngoài ra, nhiều nuôi cấy các loài nhân sâm in vitro có thể bổ sung thêm các phytohormone kết hợp với các elicitor để tăng tích lũy saponin. Yun-Soo và cs (2003, 2009) đã chứng minh, việc bổ sung 0,025 mg/L thidiazuron có thể ngăn chặn những tác động tiêu cực của MeJA lên tăng trưởng toàn bộ cây và tăng sản lượng saponin cao hơn với việc chỉ dùng MeJA.

Tuy nhiên, mức tăng này trong cây chủ yếu do tăng sinh khối hơn là kích thích trao đổi chất thứ cấp, bởi vì, chỉ khảo sát tăng trưởng rễ khi thêm MeJA.

Trong một số trường hợp, xử lý elicitor trong nuôi cấy in vitro không chỉ làm tăng sản xuất saponin mà còn làm thay đổi thành phần hóa học của các tiền chất và sản phẩm cuối cùng của chu trình. Ví dụ, trong nuôi cấy quy mô lớn tế bào sâm Tam thất với 200 mM MeJA hoặc HEJ, Xiang-Yang và cs (2003) đã xác định được một số tác động của enzyme NADPH oxidase, H2O2 và các elicitor lên khả năng trao đổi chất của màng tế bào trong việc sinh tổng hợp saponin. Squalene synthase và SE giúp mức phiên mã tăng gấp 6 lần sau 24 giờ xử lý với 200 mM HEJ. Tổng số ginsenoside tăng từ 12 giờ đến 10 ngày sau khi bổ sung HEJ hoặc MeJA. Khi bổ sung các chất ức chế jasmonate DIECA (NA-diethyldithio-carbamat), jasmonic acid giảm đi và hàm lượng ginsenoside cũng giảm theo. DIECA cũng ức chế sinh tổng hợp HEJ cần cho việc tạo SS (squalene synthase) và squalene epoxidase (SE) liên quan đến con đường truyền tín hiệu jasmonate trong tổng hợp saponin.

Trong nuôi cấy tế bào sâm Tam thất, khi tăng hoạt động enzyme UGRdGT (glucosyl transferase) sẽ tăng xúc tác chuyển hóa Rd1 thành Rb1 (một trong hai saponin chính của P. ginseng). Nhưng ginsenoside-αarabinofuranase xúc tác thủy phân ginsenoside-Rc thành Rd vẫn chưa được phát hiện.

Con đường sinh tổng hợp từ Rd để tạo Rb1 hiện diện trong các dòng tế bào và MeJA là tác nhân kích hoạt quá trình này thông qua hoạt động UGRdGT. Các kết quả khác cũng cho thấy, xử lý với MeJA hoặc HEJ làm hoạt động gen UGRdGT gia tăng cùng với hàm lượng ginsenoside Rb1.

Ngoài những elicitor phổ biến trên, Kim và cs (2009) cho thấy, tia γ cũng là một elicitor không những thúc đẩy sinh tổng hợp saponin mà còn làm tăng sinh khối, hiệu quả chiếu xạ cho tỷ lệ phát sinh RBĐ cao nhất đến 75% ở mức chiếu xạ 30 Gy, các dòng đột biến có sinh khối gấp 100 lần so với đối chứng và có sự gia tăng cả 7 loại saponin trong nuôi cấy

Cho đến nay, các nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh nhằm nâng cao hàm lượng các chuyển hóa thứ cấp còn rất hạn chế.

This div height required for enabling the sticky sidebar
error: Content is protected !!
Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views : Ad Clicks : Ad Views :